1. Геном, клонирование, происхождение человека. – Под ред. Л.И. Корочкина. – Фрязино: «Век 2», 2004. – 224 с.
2. Вымершие звери и птицы, которых проще всего клонировать. – Электронный ресурс. – 2013.
3. Андреева, Л.Е., В.З. Тарантул. Трансгенные животные: фундаментальные и прикладные аспекты / Л.Е. Андреева, В.З. Тарантул // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 / Отв. ред. Е.Д.Свердлов. – М.: Наука, 2003. – С. 184 – 217.
4. Клонирование человека. Вопросы этики. – Париж, Изд-во ЮНЕСКО, 2004. – 21 с.
Тема № 4. Современные методы исследования генома
Краткое содержание:
1. Классический подход к расшифровке последовательностей ДНК
2. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК
3. Достижения и перспективы секвенирования
4. Использование методов биоинформатики в секвенировании
5. История прочтения генома человека
Невозможно представить себе современную биологию (не только молекулярную биологию и биохимию, но и систематику, теорию эволюции, антропологию, медицину) без мегабайтов прочитанных последовательностей ДНК, этой плоти и крови биоинформатики , самой динамично развивающейся области биологической науки. Успех в этой области был достигнут в конце ХХ в. благодаря прорыву в создании технических устройств и технологий расшифровки геномов. Определение последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК получило название секвенирования (от англ. sequence – последовательность), а приборы, предназначенные для этой цели, именуются секвенаторами .
1. Классический подход к расшифровке последовательностей днк
Самый распространенный на сегодняшний день способ секвенирования ДНК - «метод терминации цепи », или «дидезокси метод », разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером (дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.)). Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным «золотым стандартом » среди всех существующих способов определения последовательности нуклеотидных остатков ДНК. Так был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сэнгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике.
амплифицируются
Вначале фрагменты ДНК, последовательность которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются ), затем нарезаются на короткие куски, которые служат матрицей для синтеза комплементарных цепей ДНК. Синтез в общих чертах напоминает процесс копирования ДНК в живой клетке.
Особенность метода заключается в использовании химически модифицированных разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов , составляющих цепи ДНК. Каждая разновидность «помечена» флуоресцентной молекулой-маркером, на жаргоне «краской». Короткий фрагмент ДНК, называемый затравкой, или праймером , инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы. Синтезирует комплементарную цепь особый фермент - ДНК-полимераза . При этом флуоресцентно меченные разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи.) В результате получается смесь, содержащая полный набор ново-синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы.
Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные гелем. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. (Фрагменты ДНК - по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от «минуса» к «плюсу».) Процесс, называемый капиллярным электрофорезом , настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется, он освещается лазером, что заставляет светиться меченый нуклеотид на его конце. Компьютер определяет разновидность этих нуклеотидов по цвету вспышки и регистрирует последовательность их появления, складывая «буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК). В случае расшифровки целого генома так нарабатываются миллиарды коротких «текстов», которые поступают в специальную программу, запускаемую на суперкомпьютерах. Программа находит места перекрывания «текстов» и, располагая их в нужном порядке, выстраивает полную последовательность генома.
Большинство новых технологических разработок направлено на миниатюризацию , мультиплексирование (в данном случае, параллельное соединение низкопроизводительных блоков системы для повышения общей производительности) и автоматизацию процесса секвенирования. Все они могут быть разделены на два класса. Первый объединяет методы «секвенирования синтезом», в которых основания определяются по мере того, как они встраиваются в растущую цепь ДНК.
Ко второму классу относятся технологии расшифровки последовательности оснований единичной молекулы ДНК. Некоторые из них достаточно экзотичны - как, например, чтение нуклеотидных остатков ДНК электронным или оптическим способом по мере того, как молекула «протискивается» через нанопору . Длинный перечень улучшений системы капиллярного электрофореза в сочетании с возрастающей автоматизацией и усовершенствованием программного обеспечения позволили снизить стоимость секвенирования в 13 раз с тех пор, как первые автоматические секвенаторы появились в 90-е годы.
Но все это выглядит несколько бледно на фоне возможностей нового метода секвенирования синтезом - изощрённого варианта пиросеквенирования, разрабатываемого и внедряемого компанией 454 Life Sciences.
2. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК
Технология, разработанная компанией 454 Life Sciences, называется пирофосфатным секвенированием, или пиросеквенированием . Сама идея пиросеквенирования, надо сказать, не нова: она возникла ещё в начале 90-х годов прошлого века, но опубликованный тогда метод не сумел вытеснить традиционный дидезокси метод Сэнгера. Однако разработчики из 454 Life Sciences дополнили его возможностями современных нанотехнологий, и количество перешло в качество. Поэтому, точнее будет назвать метод «пиросеквенированием ДНК в плотно упакованных пиколитровых реакторах».
Скорость является одним из главных преимуществ нового метода секвенирования. Название метода заимствовано у знаменитого на Западе автомобиля Chevrolet Chevelle SS 454 1970-го года с двигателем мощностью 360 лошадиных сил.
Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на кусочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер », который позволяет отдельным цепям налипать на пластиковые бусинки . (Последовательность этого олигонуклеотида позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.) При этом смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая бусинка получает лишь по одной (!) индивидуальной цепи.
Каждая бусинка оказывается заключённой в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и проходит отдельно в каждой капельке эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР , эПЦР). Это приводит к «клональной амплификации» цепей ДНК, а говоря по-русски, к тому, что на поверхности бусинки удерживается уже не одна, а около 10 млн копий («клонов») уникальной ДНК-матрицы.
Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются, и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла » - слайда особой конструкции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор» , в котором и будет происходить реакция секвенирования.
Слайд представляет собой срез блока , полученного путём нескольких циклов вытягивания и сплавления оптических волокон. В результате каждого цикла диаметр индивидуальных волокон уменьшается по мере того, как волокна формируют пучки шестигранной упаковки увеличивающегося поперечного диаметра. Каждое волокно имеет сердечник диаметром 44 мкм, окружённый 2–3 мкм слоем оболочки. Затем сердечники вытравливаются, и в результате получаются лунки ≈55 мкм глубиной, с расстоянием ≈50 мкм между центрами соседних лунок. Объём таких «реакторов» - 75 пиколитров; плотность размещения на поверхности слайда - 480 лунок на квадратный миллиметр. Каждый слайд несёт около 1,6 миллионов лунок, в каждую из которых попадает одна (!) бусинка с ДНК-матрицей. Слайд помещается в проточную камеру таким образом, что над отверстиями лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в лунки поступают необходимые реактивы.
Доставляемые в проточную камеру реактивы текут в слое, перпендикулярном оси лунок. Такая конфигурация позволяет одновременно осуществлять реакции на бусинках, несущих ДНК-матрицы, внутри отдельных лунок. Добавление и удаление реагентов и продуктов реакции происходит за счёт конвекционного и диффузионного переноса. Время диффузии между потоком и лунками составляет около 10 секунд и зависит от высоты проточной камеры и глубины лунок. Глубина лунок тщательным образом рассчитана исходя из следующих соображений:
1. Лунки должны быть достаточно глубокими, чтобы бусинки, несущие ДНК-матрицу, не выскакивали из них под действием конвекции.
2. Они должны быть достаточно глубокими, чтобы исключить диффузию продуктов реакции из лунок, где имело место включение нуклеотида, в лунки, где включения не произошло.
3. Лунки должны быть мелкими настолько, сколько требуется для осуществления быстрой диффузии нуклеотидов в лунку и быстрого вымывания оставшихся нуклеотидов и продуктов реакции в конце каждого цикла, что, в свою очередь, необходимо для обеспечения высокой продуктивности секвенирования и снижения расходов реактивов.
Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую лунку «насыпают» ещё бусинок помельче - каждая с «сидящими» на её поверхности (иммобилизованными ) ферментами , необходимыми для пирофосфатного секвенирования. Нуклеотиды (одного вида за раз) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд.
Каждый раз, когда определённый нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок, в ней высвобождается молекула пирофосфата , которая, в свою очередь, является необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции. Её катализирует особый фермент, люцифераза светлячка Photinus pyralis. Но для её осуществления необходим аденозинтрифосфат (АТФ). Новообразованный пирофосфат превращается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента - АТФ-сульфурилазы . И тогда люцифераза окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией - по-простому, маленькой вспышкой света. Дно слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, подключённым к прибору с зарядовой связью (CCD-сенсор, charge coupled device ). Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна каждой индивидуальной лунки, в которой произошло встраивание известного нуклеотида. Общая схема пиросеквенирования дана на рис. 1.
Связывая зарегистрированные от каждой лунки вспышки с типом нуклеотида, присутствующего в проточной камере в данный момент времени, компьютер последовательно отслеживает рост цепочек ДНК в сотнях тысяч лунок одновременно. Время, необходимое для протекания ферментативной реакции, производящей детектируемую «вспышку», составляет порядка 0,02–1,5 секунд. Таким образом, скорость реакции определяется скоростью массопереноса, что оставляет место для улучшений за счёт ускорения доставки реактивов. После поступления в проточную камеру каждого нуклеотида, она промывается раствором, содержащим фермент апиразу . Таким образом, перед тем как «запустить» в камеру следующий нуклеотид, из всех лунок удаляются любые нуклеотиды, остававшиеся там от предыдущего раунда.
Включение того или иного нуклеотида детектируется в результате высвобождения неорганического пирофосфата и последующего излучения света. Определить лунки, содержащие бусинки с матричной цепью ДНК, можно, прочитав «последовательность - ключ» адаптерного олигонуклеотида, пришитого к началу каждой ДНК-матрицы. Из регистрируемого сигнала вычитается уровень фона, затем сигнал нормализуется и корректируется.
Интенсивность нормализованного сигнала для каждой конкретной лунки во время поступления в проточную камеру определённого нуклеотида пропорциональна числу встроенных нуклеотидов. Линейность зависимости сохраняется для гомополимеров длиной как минимум в восемь нуклеотидов. При таком секвенировании синтезом очень небольшое число ДНК-матриц на каждой бусинке теряет синхронизм , т. е. вырываются вперёд или начинают отставать от других матриц. Исправление таких сдвигов необходимо, поскольку потеря синхронизма создаёт кумулятивный эффект , сильно снижающий качество прочтения при увеличении его длины. С учетом этого, сотрудники компании 454 разработали особый алгоритм, позволяющий оценивать и вносить поправки на «перелёт» и неполную достройку цепи, происходящие в отдельных лунках. Высокая точность расшифровки последовательности достигается тем, что система осуществляет многочисленное прочтение одного и того же фрагмента, что позволяет построить единую обобщённую (так называемую консенсусную ) последовательность.
Отдельные прочтения (риды – от англ. reаd, читать) одного и того же участка ДНК выравниваются относительно друг друга исходя из интенсивности сигналов в момент протекания через камеру того или иного нуклеотида, а не на основе последовательности этих прочтений. Затем соответствующие сигналы усредняют, и только тогда записывают полученную последовательность. Такой подход значительно улучшает качество расшифровки последовательности и предоставляет возможность оценки её качества.
В 2005 г. учёные из 454 Life Sciences, используя свою технологию, сумели расшифровать состоящий из 600 тысяч нуклеотидов геном бактерии Mycoplasma genitalium с точностью 99,4%, а также состоящий из 2,1 млн нуклеотидов геном Streptococcus pneumoniae .
Рисунок 1 - Схема пиросеквенирования. А - ДНК фрагментируется, к фрагментам пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры»; полученные двуцепочечные молекулы ДНК разделяются на две комплементарные цепи. Б - Одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам в условиях, стимулирующих попадание лишь одной молекулы на бусинку. Отдельные бусинки заключаются в капли реакционной смеси, окруженные маслом. Количество молекул на бусинке увеличивается в миллионы раз в результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР). В - Эмульсия разбивается, и цепи ДНК-фрагментов, образовавшиеся в результате эПЦР, разделяются. Бусинки, несущие на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фрагмента ДНК, помещаются в лунки оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку. Г - В каждую лунку добавляются бусинки поменьше, несущие на своей поверхности ферменты, необходимые для пиросеквенирования. Д - Микрофотография эмульсии, изображающая «пустые» капли и капли, содержащие бусинки с ДНК-матрицей. Толстая стрелка указывает на 100-мкм каплю, тонкая - на 28-мкм бусинку. Е - Микрофотография фрагмента оптико-волоконного слайда, полученная при помощи сканирующего электронного микроскопа. Видны оболочки оптических волокон и пустые лунки
В статье, в которой впервые был представлен и опробован новый метод, сообщается, что весь геном Mycoplasma genitalium был прочтён за один раз! Сначала весь геном был фрагментирован и превращён в библиотеку кусочков ДНК, как описано выше (труд одного человека на протяжении 4-х часов). После проведения эмульсионной ПЦР и помещения полученных бусинок с ДНК-матрицами на 60 мм 2 слайд (на что одному сотруднику потребовалось 6 часов), процесс завершился 4-х часовой автоматической работой инструмента, состоящей из 42 циклов.
В результате сборки прочитанных последовательностей (каждый около 108 пар оснований) было получено 25 отдельных непрерывных фрагментов, так называемых контигов (от англ. contigious –соприкасающийся), средней длиной в 22,4 тысяч пар оснований. Эти фрагменты покрыли около 96,54% всего генома микоплазмы. Из оставшихся непрочтёнными 4,6% генома, 3% приходились на неразрешимые повторы . Таким образом, за один раз было отсеквенировано 99,5% уникальной последовательности генома.
3. Достижения и перспективы секвенирования
Хотя первая версия инструмента от компании 454 Life Sciences легко могла заменить более 50 капиллярных секвенаторов Applied Biosystem 3730XL по цене в шесть раз меньшей, реакция научного сообщества была на удивление прохладной. Вместо того чтобы принять новую технологию и начать использовать её неисчерпаемый потенциал, многие учёные, привыкшие к использованию метода Сэнгера, заговорили о таких проблемах, как точность расшифровки, длина отдельных прочтений, стоимость инфраструктуры... А кто-то просто восставал против необходимости работать с большими массивами информации, производимыми с использованием новой технологии.
Большинство критиков, однако, не заметили, что множество препятствий, стоящих на пути метода секвенирования следующего поколения, преграждали на первых порах путь и методу Сэнгера. Тогда длина прочтений составляла всего 25 пар оснований, и достигла 80 только после появления терминирующих дидезокси-нуклеотидов Фреда Сэнгера. Технология «секвенирования синтезом», основанная на выделении пирофосфата, изначально позволяла прочитывать отрезки длиной не более 100 нуклеотидов. Спустя 16 месяцев на биотехнологическом рынке, этот показатель был улучшен до 250 пар оснований. Последние разработки позволяют считывать уже около 500 пар оснований, приближая новый метод к методу Сэнгера с его ≈1000 нуклеотидами.
Другим важным фактором, помимо длины отдельных прочтений, является число прочтений , производимое в результате одного «прогона » секвенатора, нормированное на стоимость такого «прогона». Этот вопрос хорошо решается конкурентами 454 Life Sciences, системы которых производят в десять раз больше прочтений, платя за это укорочением их длины, составляющей всего 35 (или меньше) нуклеотидов. Сегодня на рынке существует три коммерческих системы нового поколения для секвенирования ДНК:
Roche (454) GS FLX Genome Analyzer, распространяемый Roche Applied Sciences. (Компания 454 LIfe Sciences выкуплена гигантом Roche Diagnostics в марте 2007 г. за 154,9 млн. долларов, но продолжает оставаться независимым подразделением);
Секвенатор Illumina Solexa 1G и
Наиболее свежая система SOLiD от Applied Biosystems.
Другие системы для расшифровки ДНК, которые уже появились на рынке, относятся к «третьему поколению » и основываются на анализе одиночных молекул. Они разрабатывались компаниями VisiGen и Helicos.
И хотя прочтение бактериального генома за раз было впечатляющим достижением, поначалу не было ясно, какие биологические задачи , недоступные старому доброму методу Сэнгера, можно будет решать, взяв на вооружение новый метод пиросеквенирования. И действительно, первые проекты с участием инструмента Roche 454 GS20 заключались лишь в «перечитывании» уже расшифрованных бактериальных геномов и подкреплении дополнительными данными уже идущих больших «Сэнгеровских проектов». В то же время исследования в области метагеномики , помимо работы с огромными массивами данных, порою бóльшими, чем геном человека, страдали от искажений, вносимых на стадиях конструирования библиотек и клонирования фрагментов для секвенирования.
В этом смысле технология 454, сочетающая эПЦР и пиросеквенирование, обладает неоспоримым преимуществом перед методом Сэнгера. Эмульсионная ПЦР позволяет амплифицировать без всяких предпочтений единичные молекулы ДНК, заключая их в капельку эмульсии и устраняя конкуренцию со стороны других ДНК-матриц за ограниченное число ДНК-полимераз. Пиросеквенирование, в свою очередь, осуществляет параллельное прочтение этих матриц со световым сигналом на выходе, который может считываться компьютером. Первые подобные исследования, опубликованные в 2006 году, показали необыкновенную гибкость метода нового поколения, использованного при изучении микробного многообразия подземных экосистем глубокой шахты, глубоководных морских экосистем, морских вирусных «сообществ» («виромов ») в нескольких океанах.
Интересное исследование, сочетающее в себе метагеномный анализ и «ДНК-палеонтологию », было проведено в конце 2005 г. Одного запуска инструмента Roche (454) GS20 было достаточно для анализа 13 млн. пар оснований последовательности генома 28 000-летнего мамонта . Эта работа проложила дорогу для технически более трудного проекта расшифровки генома неандертальца . Трудность такого проекта состоит в том, что количество выделяемой из образцов костей древней ДНК неандертальца составляет всего лишь 5% от количества, получаемого из «свежего материала». Следовательно, секвенировать приходится в 20 раз дольше, чем это необходимо для генома современного человека. Кроме того, вклад разрушения ДНК в образцах, сохраняемых при умеренных температурах, в сочетании с ошибками, присущими новому методу пиросеквенирования, часто превосходит уровень различия, установленный для геномов неандертальца и современного человека. Поэтому утверждать, что полученная последовательность действительно древняя, а не случайно попавшая в препарат современная ДНК, значительно легче в случае с мамонтом - современные слоны, в отличие от людей, не часто встречаются в лабораториях. Для того чтобы получить настоящую последовательность древнего генома млекопитающего, необходимо провести множество раундов прочтения каждого участка генома, а также удостовериться в происхождении прочитанных участков.
Вместе с прорывом в области секвенирования сложных смесей ДНК, такие проекты сделают возможным изучение любой экосистемы на планете на уровне последовательностей ДНК. Это откроет доступ к флоре и фауне 100-тысячелетней давности - возможности, превосходящие самые смелые ожидания совсем недалекого прошлого.
На клеточном уровне секвенирование нового поколения (здесь и далее речь идёт не только о пиросеквенировании, но и о других новых методах секвенирования синтезом) впервые позволяет учёным идентифицировать мутации в любом организме для всего генома. Так были найдены аллели, отвечающие за устойчивость к антибиотику у Mycobacterium tuberculosis , а также идентифицированы все мутации в геноме размером в 9 млн пар оснований у штамма бактерии, эволюционировавшей на протяжении 1000 поколений. Эти ранние попытки не только продемонстрировали способность новой технологии обнаруживать мутации и ошибки в опубликованных научных статьях, но и связанные с её использованием трудности, такие как ошибки прочтения гомополимерных последовательностей при пиросеквенировании (454) или быстрое уменьшение качества прочтения ближе к 3’-концу последовательности в системах с короткой длиной индивидуальных прочтений (Solexa или SOLiD от Applied Biosystem).
Раньше для преодоления этих трудностей данные, полученные пиросеквенированием, дополняли информацией, полученной классическим сэнгеровским путём. Но поскольку стоимость и затраты, требуемые сэнгеровской составляющей эксперимента, остаются отталкивающе высокими, многие лаборатории сегодня полагаются только на методы нового поколения, обычно сочетая относительно длинные прочтения пиросеквенирования с короткими, но дешевыми (а значит, и многочисленными) прочтениями, осуществляемыми системами Solexa и SOLiD. Такое сочетание различных платформ позволяет производить независимую оценку качества их работы, а также проверять эталонные последовательности, хранящиеся в общественных базах данных.
Получение большого количества последовательностей ДНК из различных близкородственных организмов движет вперед и развивает подход, названный повторным секвенированием (resequencing), в котором работа с последовательностями ведётся иначе, чем при сборке свежесеквенированного генома. При повторном секвенировании сборка направляется уже имеющейся под рукой эталонной последовательностью, и поэтому требует значительно меньшего покрытия (8–12-ти кратного), чем при сборке генома de novo (25–70-ти кратного). Этот подход был применён в работе по расшифровке 10 митохондриальных геномов млекопитающих, которая сделала возможными исследования в области генетики популяций, основанные не на коротких отрезках последовательности, а на полных геномах митохондрий. В настоящий момент многочисленные проекты по расшифровке микробных геномов ведутся не только для расширения списка доступных геномов, но и для проведения будущих сравнительных исследований, сопоставляющих генотип и фенотип организма на геномном уровне.
Далеко может продвинуться также и работа по изучению организмов, которые не стоят в планах по геномному секвенированию - благодаря возможностям новых методов секвенирования напрямую расшифровывать последовательности транскриптов (точнее, кДНК - ДНК-копий матричных РНК) в клетке. Изучение транскриптов посредством прямого секвенирования обладает рядом преимуществ перед методом гибридизации на ДНК-микрочипах. Главное здесь то, что секвенирование не требует никаких знаний о геномной последовательности организма a priori , поскольку последовательность транскрипта может быть немедленно сравнена с эталонной последовательностью близкородственного вида из базы данных, используя стандартные алгоритмы биоинформатики. Знание последовательностей транскриптов может в корне изменить исследования организмов, геномы которых сегодня не стоят в очереди на расшифровку, а в некоторых случаях никогда там и не окажутся. Первые работы в этой области показали, что существует возможность сопоставлять последовательности (кДНК и геномные, соответственно) двух таких далёких друг от друга видов, как бобовое Meticago truncatula и растение-эталон Arabidopsis thaliana . Также было обнаружено множество не описанных ранее транскриптов кукурузы Zea mays .
Прямой анализ транскриптов поможет обойти проблему, которую ставят перед учёными организмы с непомерно большими геномами. Несмотря на успешно проведённые проекты по расшифровке вирусных, бактериальных и больших геномов млекопитающих, метод Сэнгера оставил задачу по расшифровке геномов полиплоидных растений своим преемникам. Эти гигантские геномы, частенько принадлежащие важным хозяйственным растениям (например, геном пшеницы составляет 16 млрд пар оснований), делали все предыдущие попытки по расшифровке бесплодными. Однако перспектива дешёвого секвенирования экспрессируемых участков генома (то есть транскриптов) позволяет надеяться на успешное изучение геномов таких растений хотя бы на функциональном уровне.
И наконец, новые методы секвенирования имеют практическое применение и в медицине. Например, в генетике раковых заболеваний, специфические раковые аллели могут быть отслежены в тканях посредством высокопроизводительного секвенирования геномной ДНК в тех случаях, когда метод Сэнгера терпит поражение. И здесь большим преимуществом нового метода оборачивается многократное прочтение последовательности.
Несмотря на то, что новые методы секвенирования ДНК уже стимулировали большое количество всевозможных исследований, осуществление которых было невозможно ещё в недалёком прошлом, учёным и инженерам, занимающимися разработкой этих технологий - а равно как и компаниям, продвигающим эти технологии на рынке, - предстоит многое сделать для её улучшения. Прежде всего, снизить стоимость . Уменьшение цены на один-два порядка необходимо для осуществления надежд на персональную геномику , цель которой - повторное секвенирование индивидуальных геномов по цене, не превышающей 1000 долларов. В дополнение к этому, снижение процента ошибок будет также горячо приветствоваться - не только для методов следующего поколения, но и для метода Сэнгера, который будет продолжать вносить вклад и в обозримом будущем. Возможно, появятся искусственно изменённые специализированные ДНК -полимеразы , предоставляющие информацию о последовательности ДНК в виде испускаемого светового сигнала. По мере того, как стоимость технологий будет снижаться, количество накапливаемой информации будет расти лавинообразно, что может создать «узкое место» в исследованиях. Поэтому часть усилий по разработке новых технологий секвенирования необходимо направить на развитие биоинформатики .
Созданного 4 года назад с целью максимально полной расшифровки информации, закодированной в геноме человека, сообщили о завершении первого этапа работы. Более 300 исследователей из США и других стран провели детальный анализ структуры и функции одной сотой части человеческого генома (30 млн пар оснований из 3 млрд). В клетках человека обнаружено неожиданно большое разнообразие транскриптов — молекул РНК, синтезированных на матрице геномной ДНК. Выяснилось, что первичному прочтению (транскрипции) подвергается 80% генома, несмотря на то, что кодирует белки лишь 2% генома. Этот и другие результаты говорят о том, что механизмы функционирования генома сложнее, чем принято считать, и сам «язык», на котором записана наследственная информация, нам еще не до конца понятен.
Хотя геном человека был объявлен «прочтенным вчерне» еще в 2000-2001 гг., а в 2003-2004 гг. заговорили о «почти совсем полном прочтении», наука по-прежнему далека от полного понимания закодированной в геноме информации. Для решения этой глобальной задачи в 2003 году Национальным институтом по изучению генома человека (National Human Genome Research Institute, NHGRI) был запущен проект ENCODE (Enc yclopedia o f D NA E lements), объединивший сотни ученых и десятки научных коллективов из США и других стран.
Задача-максимум, стоящая перед участниками проекта, состоит в том, чтобы выяснить, зачем нужен и что кодирует каждый из 3 млрд нуклеотидов человеческого генома. Причем выяснить не только теоретически, in silico (путем компьютерного анализа последовательностей ДНК), но и подтвердить результаты экспериментально. До решения этой задачи, разумеется, еще очень далеко. Пока же ученые отрапортовали о завершении первого этапа работы, целью которого была в основном отработка методик и проба сил.
Ученые использовали весь обширный арсенал средств и методов современной генетики, геномики и молекулярной биологии. В частности, широко использовалось сравнение человеческого генома с геномами других млекопитающих (см.: Геном макака резуса расскажет об эволюции человека , «Элементы», 19.04.2007; Прочтение генома опоссума доказало ключевую роль транспозонов в эволюции млекопитающих , «Элементы», 13.05.2007). Такое сравнение позволяет выявить «консервативные», то есть схожие у разных видов участки генома. Консерватизм обычно свидетельствует о функциональной важности данного участка (см.: Сравнение геномов человека и мыши помогло обнаружить новый способ регуляции работы генов , «Элементы», 21.04.2007).
Но главным «коньком» проекта ENCODE является тотальный анализ транскриптома , то есть тех молекул РНК, которые синтезируются клеткой на матрице геномной ДНК в ходе транскрипции — «прочтения» генетической информации. Напомним, что информация, закодированная в классических белок-кодирующих генах, реализуется в два этапа: сначала на матрице ДНК синтезируется РНК (транскрипция), затем на матрице РНК синтезируется белок (трансляция).
Ранее уже было известно, что только 2% генома человека кодируют белки. Лишь эти два процента генетического «текста» подвергаются не только транскрипции, но и трансляции. Было известно и то, что транскрипции подвергаются также и многие нетранслируемые участки генома. Это, во-первых, гены функциональных РНК (транспортных, рибосомных и разнообразных регуляторных), во-вторых — интроны, некодирующие «вставки», имеющиеся в большинстве белок-кодирующих генов. Перед трансляцией интроны вырезаются из молекул РНК (это называется сплайсингом). Одно из главных достижений проекта ENCODE состоит в том, что наконец удалось выяснить, какая доля геномной ДНК подвергается транскрипции в человеческих клетках. Оказалось — целых 80%, гораздо больше, чем предполагалось. До начала выполнения проекта было известно, что в той сотой части генома, которую предстояло изучить, есть 8 генов нетранслируемых РНК. Оказалось, что в действительности их тысячи.
Исследователи пока не могут точно сказать, какую функцию выполняют все эти транскрипты. Не исключено, что некоторые из них не выполняют никакой специальной функции и являются всего лишь побочным продуктом деятельности ферментов РНК-полимераз — деятельности, которая, вероятно, является отчасти хаотической (о хаотических аспектах работы некоторых белков см.: Работу регуляторного белка впервые пронаблюдали под микроскопом , «Элементы», 31.05.2007; Разгадан механизм движения «шагающего белка» , «Элементы», 29.05.2007). Но многие из обнаруженных транскриптов все-таки зачем-то нужны. Это подтверждается тем, что в них имеются консервативные участки, почти одинаковые у человека и мыши.
Изучение транскриптов, считанных с обычных белок-кодирующих генов, тоже преподнесло сюрпризы. Всего в пределах изученного участка генома находится 400 таких генов. Более чем у 80% из них анализ транскриптов выявил наличие неизвестных ранее функциональных фрагментов — экзонов (экзонами, в отличие от интронов, называют те участки гена, которые кодируют белок). Некоторые из этих экзонов, как выяснилось, находятся в геномной ДНК на расстоянии тысяч пар нуклеотидов от всех остальных экзонов того же гена, иногда они даже оказываются внутри другого гена. То, что гены высших организмов состоят из кодирующих кусочков-экзонов, разделенных некодирующими вставками-интронами, было известно давно, но никто не знал, что экзоны многих человеческих генов находятся так далеко друг от друга и так причудливо разбросаны. Более того: были обнаружены транскрипты, содержащие экзоны двух разных генов.
Всё это заставляет признать, что мы до сих пор не очень хорошо представляем себе, что же такое ген и как он работает. Некоторые из участников проекта позволили себе даже высказаться в прессе в том смысле, что, мол, ген — понятие отчасти устаревшее, а на самом деле фундаментальными единицами генома являются транскрипты (как сказал кто-то из теоретиков — «мы до сих пор живем в мире РНК»). Другие не согласны с этим: по их мнению, ген остается центральным объектом молекулярной биологии, только вот определение этого понятия нужно подкорректировать.
В ходе выполнения проекта исследователи разработали целый ряд новых методик, которые пригодятся им в дальнейшем — например, научились гораздо лучше искать регуляторные участки ДНК, в том числе сайты начала транскрипции (промоторы) — последовательности нуклеотидов, сигнализирующие РНК-полимеразам о том, что в этом месте следует начинать транскрипцию. До начала выполнения проекта ENCODE в этой части генома человека было известно 532 промотора, сейчас их уже 775, и вдобавок много предположительных, ожидающих экспериментального подтверждения.
Назовем еще некоторые из полученных результатов:
Гистоны — специальные белки, на которые «наматывается» геномная ДНК в клеточном ядре — определенным образом модифицируются вблизи сайтов начала транскрипции и других регуляторных элементов; по характеру этих модификаций можно даже предсказывать наличие тех или иных регуляторных элементов в данном участке ДНК.
Примерно 5% нуклеотидов в геноме млекопитающих безусловно находятся под действием стабилизирующего (очищающего) отбора, иными словами, они консервативны — темп их эволюционных изменений сильно замедлен.
Для 60% этих консервативных оснований имеются экспериментальные подтверждения наличия функции — то есть они действительно зачем-то нужны, что-то кодируют.
Многие фрагменты ДНК с экспериментально подтвержденной функциональной ролью не являются, однако, эволюционно консервативными — последовательность нуклеотидов в них быстро менялась в ходе эволюции млекопитающих. По-видимому, многие из этих участков кодируют функции, не являющиеся жизненно важными. Такие участки могут служить хорошим «материалом для отбора». Кстати, сами исследователи именно этот результат считают наиболее неожиданным: раньше думали, что практически всё функциональное в геноме должно быть консервативным.
Функциональные фрагменты ДНК имеют разную степень вариабельности в пределах человеческой популяции: одни из них почти одинаковы у всех людей, другие могут очень сильно различаться.
Стоимость первого этапа исследований составила $42 млн. На продолжение работы NHGRI намерен выделять $23 млн ежегодно. Предполагается, что через 4 года весь геном человека будет подвергнут столь же глубокому анализу, как и изученная на сегодняшний день сотая часть. Ускорение и удешевление процесса будет обеспечено за счет новых методик, разработанных участниками проекта.
Источники:
1) The ENCODE Project Consortium. Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project (полный текст — Pdf, 4,5 Мб) // Nature
. 2007. V. 447. P. 799-816.
2) Elizabeth Pennisi. DNA Study Forces Rethink of What It Means to Be a Gene // Science
. 2007. V. 316. P. 1556-1557.
Об исследованиях генома человека см. также:
1) Проект «Геном человека» .
2) Эволюция человека сопровождалась изменением активности генов-регуляторов , «Элементы», 13.03.2006.
3) Люди отличаются от шимпанзе не тем, чем хотели , «Элементы», 30.11.2006.
4) Будут ли расшифрованы генетические основы разума? , «Элементы», 09.10.2006.
5) Почему шимпанзе не болеют раком , «Элементы», 08.02.2006.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДНК
1. Для выделения ДНК из гомогената тканей удаляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. Белки, разрушенные
протеазами (чаще всего применяют протеиназу К), экстрагируют из раствора. Затем ДНК осаждают, например, этанолом и после удаления надосадочной
жидкости ДНК растворяют в буферном растворе.
2. Молекула ДНК среднего размера содержит 150 000 000 нуклеотидных пар и имеет длину 4 см.
Поэтому молекулы ДНК чувствительны к сдвиговым усилиям, возникающим в растворе, и в процессе выделения ДНК из тканей она фрагменти-руется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень большие - тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их приходится дополнительно фрагментировать.
Для фрагментирования используют рестриктазы - ферменты, выделяемые из бактерий. У бактерий эти ферменты участвуют в уничтожении чужеродных для них ДНК. Рестриктазы «узнают» специфические последовательности из 4-6 нуклеотидов (сайты рестрикции), которые встречаются в ДНК человека. Известно множество различных рестриктаз, причем каждая из них «узнает» свой сайт рестрикции (рис. 3.3).
С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. Например, для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных пар н.п. Следовательно, цельную молекулу ДНК в 150 000 000 н.п. нужно разрезать на 500 000 фрагментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения некоторых исследований необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной ДНК. Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК и получить за 3-4 ч несколько миллионов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д. Подробно этот метод и его применение в ДНК-диагностике будут рассмотрены в теме 3.10.
Гибридизация. Для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот применяют метод гибридизации. Он основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80-90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использование метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Методом гибридизации можно установить сходство и различия первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот.
Секвенирование генома.
Секвенирование генома здорового человека в большинстве случаев не способно предсказать развитие у него в будущем тех или иных заболеваний. Результаты этой работы были представлены на Ежегодной встрече Американской Ассоциации по исследованию рака (Association for Cancer Research), а также опубликованы в журнале Science Translational Medicine .
Полное секвенирование генома представляет собой «каталогизирование» всех генов, полученных человеком от обоих родителей, и их проверку на наличие повреждений ДНК, которые могли бы повысить восприимчивость человека к раку и иным заболеваниям. Поскольку стоимость секвенирования генома постоянно снижается (в настоящее время цена процедуры составляет 1-3 тысячи долларов США), многие здоровые люди начали задумываться над тем, чтобы пройти такое обследование и определить для себя риск развития того или иного заболевания. Однако исследователи из Центра по изучению рака Johns Hopkins Kimmel призывают их не торопиться.
Выводы ученых вовсе не означают, что секвенирование генома не имеет никакой медицинской ценности. «Во-первых, секвенирование генома остается лучшим средством для предсказания „семейных“ заболеваний, таких как рак и некоторые другие, - говорит профессор онкологии Берт Фогельштайн (Bert Vogelstein). - Во-вторых, детальное изучение генома индивидуума помогает лучше понять механизм уже протекающего у него заболевания и точнее подобрать для него индивидуальную терапию. Однако в случае со здоровым человеком геном перестает быть надежным предсказателем».
Исследователи проследили развитие 24 заболеваний у более чем 50 тысяч близнецов из 5 стран, прошедших процедуру секвенирования генома. Результаты показали, что в случае 23 заболеваний анализ генома дал отрицательный результат и отнес риск их развития к разряду «низкий». Однако, по словам профессора Фогельштайна, это вовсе не означает, что данное заболевание у данного человека не разовьется. «Это означает всего лишь, что его персональный риск немного ниже, чем средний риск по популяции, который может быть очень существенным, - говорит исследователь. - Таким образом, даже негативный результат не гарантирует отсутствия заболевания в будущем». При этом риск 4 из 24 заболеваний- заболевания сердца у мужчин, аутоиммунный тиреоидит, диабет I типа и болезнь Альцгеймера - устойчиво определялся в ¾ случаев, что позволяет назвать секвенирование генома достаточно надежным средством определения предрасположенности к этим болезням.
Современная геномика.
Длительное время геномом называли гаплоидный набор хромосом. Накопление сведений об информационной роли внехромосомной ДНК изменило определение термина «геном». В настоящее время он означает полный состав ДНК клетки, т.е. совокупность всех генов и межгенных участков. Можно считать, что геном - полный набор инструкций для формирования и функционирования индивида.
Общие принципы построения геномов и их структурно-функциональную организацию изучает геномика, которая проводит секвенирование, картирование и идентификацию функций генов и внегенных элементов. Методы геномики направлены на расшифровку новых закономерностей биологических систем и процессов. Геномика человека является основой молекулярной медицины и имеет важнейшее значение для разработки методов диагностики, лечения и профилактики наследственных и ненаследственных болезней. Для медицины первостепенное значение имеют исследования в области геномики патогенных микроорганизмов, поскольку они проливают свет на природу инфекционного процесса и создание лекарств, направленных на специфические мишени бактерий.
Геномика, несмотря на её «молодой возраст», подразделяется на несколько почти самостоятельных направлений: структурную, функциональную, сравнительную, эволюционную, медицинскую геномику.
Структурная геномика изучает последовательность нуклеотидов в геномах, определяет границы и строение генов, межгенных участков и других структурных генетических элементов (промоторов, энхансеров и т.д.), т.е. составляет генетические, физические и транскриптные карты организма.
Функциональная геномика. Исследования в области функциональной гено-мики направлены на идентификацию функций каждого гена и участка генома, их взаимодействие в клеточной системе. Очевидно, это будет осуществляться путём изучения белковых ансамблей в разных клетках. Эту область исследований называют протеомикой.
Сравнительная геномика изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования.
Эволюционная геномика объясняет пути эволюции геномов, происхождение генетического полиморфизма и биоразнообразия, роль горизонтального переноса генов. Эволюционный подход к изучению генома человека позволяет проследить за длительностью формирования комплексов генов, отдельных хромосом, стабильностью его частей, недавно обнаруженными элементами «непостоянства» генома, процессом расообразования, эволюцией наследственной патологии.
Медицинская геномика решает прикладные вопросы клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов (например, диагностика наследственных болезней, генотерапия, причины вирулентности болезнетворных микроорганизмов и т.д.).
Все шаги эволюции живой природы, несомненно, должны были закрепляться в информационной системе ДНК (а для некоторых существ - в РНК), а также в организации её в клетке для выполнения консервативной функции сохранения наследственности и противоположной функции - поддержания изменчивости. Такое представление о формировании генома каждого вида наиболее обоснованно. Применительно к геному человека можно сказать, что эволюция человека - это эволюция генома. Такое представление подтверждается теперь многочисленными молекулярно-генетическими исследованиями, поскольку стало возможным сопоставление геномов разных видов млекопитающих, в том числе человекообразных обезьян, а также в пределах вида Homo sapiens геномов разных рас, этносов, популяций человека и отдельных индивидов.
Организация генома каждого эукариотического вида представляет собой последовательную иерархию элементов: нуклеотидов, кодонов, доменов, генов с межгенными участками, сложных генов, плеч хромосом, хромосом, гаплоидного набора вместе с внехромосомной и внеядерной ДНК. В эволюционном преобразовании генома каждый из этих иерархических уровней мог вести себя совершенно дискретно (изменяясь, комбинируясь с другими и т.д.).
Наши представления о геноме человека - обширная область генетики человека, включающая по меньшей мере понятия «инвентаризации» генов, групп сцепления, картирования генов (локализация), секвенирования всей ДНК (генов, их мутаций и хромосом в целом), мейотических преобразований, функционирования отдельных генов и их взаимодействий, интеграции структуры и функции генома в целом. На решении всех этих вопросов была сосредоточена обширная многолетняя международная программа «Геном человека» (с 1990 по 2000 г.). Главным направлением работ были последовательное секвенирование участков генома и их «состыковка». Успешные разработки в этой области придали программе клинико-генетический аспект.
Клинические приложения сведений о геноме человека
Систематическое изучение генома человека фактически началось с применения менделевского анализа наследственных признаков человека (начало XX века). Генеалогический метод вошел тогда в широкую практику, и шаг за шагом стал накапливаться материал по «инвентаризации» дискретных наследственных признаков человека, но этот процесс постепенно замедлялся (за 50 лет было открыто не более 400 менделирующих признаков и 4 группы сцепления), возможности клинико-генеалогического метода в чистом виде были исчерпаны.
Бурный прогресс цитогенетики человека, биохимической генетики и особенно генетики соматических клеток в 60-х годах в комплексе с генеалогическим подходом поставил изучение генома человека на новые теоретические основы и высокий методический уровень. Обнаружение новых менделирующих признаков человека стало быстро продвигаться, особенно на биохимическом и иммунологическом уровне, появились возможности изучения сцепления и локализации генов.
Особый импульс изучению генома человека придали молекулярно-генетические методы, или технология генной инженерии (70-е годы). Процесс познания генома углубился до выделения гена в чистом виде и его секвенирования.
В отличие от классической, в новой генетике изменился подход к анализу генов. В классической генетике последовательность была следующей: идентификация менделирующего признака -> локализация гена в хромосоме (или группе сцепления) -> первичный продукт гена -> ген. В современной генетике стал возможным и обратный подход: выделение гена -> секвенирование -> первичный продукт, в связи с чем был введён новый термин для определения такого направления исследований: «обратная генетика» или «генетика наоборот».
Продолжаются совершенствование молекулярно-генетических методов и, что не менее важно, их автоматизация. В США и Великобритании были разработаны и внедрены автоматические приборы по секвенированию геномов. Их назвали геномотронами. В них осуществляется до 100 000 полимеразных реакций в час. Это означает, что в течение недели может быть просеквенирован участок (или участки) длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов.
Большую роль в расшифровке генома человека играют вычислительная техника и информационные системы. Благодаря им решаются вопросы накопления информации (базы данных) из разных источников, хранения её и оперативного использования исследователями из разных стран.
В настоящее время изучение геномов не ограничивается только картированием генов, стало возможным изучать последовательность расположения нуклеотидов в составе любого гена. Решающим шагом на пути к решению этой проблемы явилось применение особых ферментов рестрикционных эндонуклеаз и разработка метода клонирования генов.
Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) ферменты, расщепляющие ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей, которые они распознают. Эти ферменты обнаружены у многих бактерий. Они определяют и разрушают чужеродные молекулы ДНК, попадающие в клетку, в том числе при инфицировании их фагами или при трансформации. Таких ферментов обнаружено более 100, и каждый из них распознает в ДНК специфическую последовательность из 4 6 нуклеотидов. Каждая рестриктаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины. При этом образуется серия фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами. Сравнение размеров этих фрагментов, полученных при обработке бактериальных или плазмидных геномов (а также ДНК хромосом эукариот), позволяет создавать рестрикционные карты, в которых отмечается локализация каждого разреза участка относительно соседних участков других таких разрезов (рестрикций).
Существенно, что многие рестриктазы вносят разрывы в обе цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов. Вследствие этого на конце нити одного фрагмента образуется участок, нуклеотидные последовательности которого оказываются комплементарными нуклеотидным последовательностям другой нити с другого конца фрагмента. Такие концевые последовательности, комплементарные друг другу, получили название липких концов. С их помощью образовавшиеся рестрикционные фрагменты будут вновь образовывать кольца в результате спаривания липких концов. Способность рестрикционных нуклеаз разрезать ДНК с образованием липких концов широко используется в технологии создания рекомбинантных ДНК, так как при помощи таких концов можно соединить два любых фрагмента ДНК, если они получены с помощью одной и той же рестриктазы и, следовательно, имеют комплементарные липкие концы. После замыкания последних путем образования комплементарных пар оснований образовавшееся кольцо из фрагментов разных ДНК можно сшить ковалентными фосфодиэфирными связями между противоположными концами каждой нити ДНК с помощью ДНК-лигазы. В этом заключается суть технологии получения рекомбинантных молекул ДНК.
Ранее всего был изучен геном бактериального вируса ФХ174. Е го ДНК состоит из 5400 нуклеотидов и содержит 9 генов. Вирус ФХ174 можно увидеть только с помощью электронного микроскопа, а запись его генетической информации, содержащейся в 9 генах, в виде линейной последовательности через буквы (А, Т, Г, Ц) занимает целую страницу текста. Запись в таком же виде информации, имеющейся в хромосоме животной клетки, составит книгу объемом более 500000 страниц!
Изучение генома человека началось в 80-х гг. XX в. В последующем была создана Международная организация по изучению генома человека HUGO (от англ. Human Genome Organization организация генома человека). Изучением генома человека занимаются ученые США, Японии, ряда стран Европы, России и др.
Основная задача определить последовательное расположение всех нуклеотидов (а их 3,5 109 пар) во всех 23 парах хромосом человека. Предстоит выяснить молекулярные основы наследственных болезней и определить пути их лечения рано или поздно генотерапия станет вполне реальной. Уже сейчас осуществляется ДНК-диагностика более 100 наследственных болезней. После открытия структуры ДНК, гена и расшифровки генетического кода осуществление программы «Геном человека» будет означать самую фундаментальную революцию в биологии и медицине.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Введение в геномику. Геном человека, основные черты организации. Методы изучения генома человека
Значение программы изучения генома человека для практической медицины.
21 век - это эра геномики - время, когда последовательность ДНК в геноме человека определена почти полностью, время, когда анализируется роль тысяч генов человека в норме и при болезнях. Наступает время персонифицированной медицины - когда изучение небольших вариаций во многих генах приведет к выявлению индивидуальной предрасположенности человека к той или иной патологии.
Важнейшие события генетики 20 века, инициирующие изучение генома:
Открытие двойной спирали ДНК (Дж. Уотсон, Фр. Крик, 1953)
Разработка метода секвенирования ДНК - 1997 г.
Выделение эмбриональных стволовых клеток человека (1998)
Решающим достижением молекулярной биологии стала разработка методов секвенирования ДНК в 1977 г.
Международный проект Геном человека официально стартовал в 1990 году. Огромный вклад внесли ученые 6 стран - США, Великобритании, Франции, Германии, Японии и Китая. К 2001 г. просеквенировано 90% с точностью 99,99%. К 2003 г. секвенировано 99% генома человека. Осталось около 400 брешей.
В ходе выполнения проекта «Геном человека» была определена последовательность ДНК всех хромосом и митохондриальной ДНК.
Двадцать две аутосомные хромосомы, две половые хромосомы Х и Y, а также митохондриальная ДНК человека содержат вместе примерно 3,1 млрд. пар оснований .
Полное секвенирование выявило, что человеческий геном содержит 20--25 тыс. активных генов , что значительно меньше, чем ожидалось в начале проекта (порядка 100 тыс.) -- то есть только 1,5 % всего генетического материала кодирует белки. Остальная часть (97%) является некодирующей ДНК, которую часто называют мусорной ДНК . Геном человека -- совокупность наследственного материала, заключенного в клетке человека.
Вообще слово «геном» относится к общему содержанию ДНК у данного вида, включая не только гены, но и всю остальную ДНК. У человека, например, на долю кодирующих белки последовательности приходится только 1,25% всего генома. Что же представляет человеческий геном?
На долю интронов приходится до 20-25%. Но значительную часть межгенной ДНК занимают регуляторные последовательности.
Классификации генов:
Гены активные и репрессированные
Основная масса генов, активно функционирующих в большинстве клеток организма на протяжении онтогенеза,-- это гены, которые обеспечивают синтез белков общего назначения (белки рибосом, гистоны, тубулины и т. д.), тРНК и рРНК. Такие гены называют конститутивными. Работа другой группы генов, контролирующих синтез специфических белков, зависит от различных регулирующих факторов. Их называют регулируемыми генами. Изменение условий может привести к активации «молчащих» генов и репрессии активных. Дифференцированная экспрессия генома у млекопитающих обусловливает развитие огромного множества типов тканей.
Кодирующие белки и РНК
Кодирующие белок последовательности (множество последовательностей составляющих экзоны) составляют менее чем 1,5 % генома .
Кроме кодирующих белок генов человеческий геном содержит тысячи РНК-генов, включая транспортную РНК (tRNA), рибосомную РНК, микро РНК (microRNA) и прочие не кодирующие белок РНК последовательности.
Структурные гены, характеризующиеся уникальными последовательностями нуклеотидов, кодирующих свои белковые продукты, которые можно идентифицировать с помощью мутаций, нарушающих функцию белка.
Гены «домашнего хозяйства» и гены «роскоши».
Все гены разделяют на гены "домашнего хозяйства" и гены "роскоши".
Гены "домашнего хозяйства" кодируют то, что всегда нужно любой клетке независимо от ткани. Гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) -- это гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций организма, которые экспрессируются практически во всех тканях и клетках на относительно постоянном уровне. Гены домашнего хозяйства функционируют повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма.
По разным оценкам таких генов у человека 10-20 тыс. Это гистоновые гены, гены tРНК, rРНК и т.п.
Гены "роскоши", которых заведомо больше в 2-3 раза, это гены, которые экспрессируются в клетках определенных тканей и в определенное время. Например, все гены белковых гормонов - гены "роскоши".
Регуляторные последовательности -- последовательности нуклеотидов, не кодирующие специфические белки, а осуществляющие регуляцию действия гена (ингибирование, повышение активности и др.
В человеческом геноме найдено множество различных последовательностей, отвечающих за регуляцию гена. Под регуляцией понимается контроль экспрессии гена (процесс построения матричной РНК по участку молекулы ДНК). Обычно это короткие последовательности, находящиеся либо рядом с геном, либо внутри гена. Иногда они находятся на значительном расстоянии от гена (энхансеры).
Сайленсер (англ. Silencer) -- последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры (факторы транскрипции). Связывание белков-репрессоров с сайленсерами приводит к понижению или к полному подавлению синтеза РНК.
Инсулляторы
Человеческий геном состоит из 23 пар хромосом, находящихся в ядре, а также митохондриальной ДНК в виде 2-6 кольцевых молекул. Хромосомы человека. Размер хромосом варьирует от 45 миллионов до 280 миллионов пн.
Хромосома не гомогенна. В ней чередуются участки эухроматина (не плотные участки) и гетерохроматина (более плотный). При дифференциальной окраске по длине хромосомы выявляется ряд окрашенных (гетерохроматин) и неокрашенных (эухроматин) полос. Характер поперечной исчерченности, получаемый при этом, позволяет идентифицировать каждую хромосому в наборе, так как чередование полос и их размеры строго индивидуальны и постоянны для каждой пары.
ЭУХРОМАТИН, вещество хромосомы, сохраняющее деспирализованное (диффузное) состояние в покоящемся ядре и спирализующееся при делении клеток. Содержит большинство структурных генов организма.Гетерохроматин - протяженные участки повторяющихся и высоко конденсированных последовательностей, которые не кодируют никаких белков.
Классификация гетерохроматина:
Факультативный (В зависимости от стадий клеточного цикла, типа клеток, один и тот же участок хромосомы может быть в состоянинии как гетеро-, так и эухроматина. Такие участки хромосом называют факультативным гетерохроматином.
Конститутивный (околоцентромерный, теломерный) Участки, которые всегда уплотнены. Эти участки хромосом содержат тандемно повторяющуюся ДНК (расположенные друг за другом «голова к хвосту»).
Околоцентромерный гетерохроматин состоит из коротких тандемных повторов длиной до 20 п.о., организованных в длинные блоки (по 100-200 тандемов). Блоки образуют ряды длиной от 250 тыс. до 5 млн. пн. Такой тип ДНК называется сателлитной, альфоидной (альфа-сателлитной). Составляют 3% генома. В местах расположения сателлитной ДНК возможна максимальная компактизация, все четыре уровня упаковки ДНК представлены даже в интерфазе. По сателлитной ДНК происходит кроссинговер между гомологичными хромосомами.
Теломемры (от др.-греч. фЭлпт -- конец и мЭспт -- часть) -- минисателлиты - концевые участки хромосом. У большинства эукариот теломеры состоят из коротких тандемных повторов.и содержат тысячи 6-нуклеотидных повторов: у человека - TTAGGG, (для сравнения у всех насекомых -- TTAGG, у растений -- TTTAGGG). Они повторяются от 250 до 1500 раз.
С теломерами связано несколько белков, образующих защитный «колпачок» - теломерный комплекс, который предохраняет теломеры от действия нуклеаз и слипания и, видимо, именно он сохраняет целостность хромосомы и защищая всю хромосому от разрушения. Теломерные участки хромосом характеризуются отсутствием способности к соединению с другими хромосомами или их фрагментами и выполняют защитную функцию.
В каждом цикле деления теломеры клетки укорачиваются из-за неспособности ДНК-полимеразы синтезировать копию ДНК с самого конца. ДНК-полимераза может начать синтез цепи только с РНК-праймера. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры на отстающей цепи удаляются, а пропуски заполняются ДНК-полимеразой. Однако на конце цепи такой пропуск заполняться не может. Поэтому 3" участки ДНК остаются однонитевыми, а 5"недореплицированными. Следовательно, КАЖДЫЙ РАУНД РЕПЛИКАЦИИ БУДЕТ ПРИВОДИТЬ К УМЕНЬШЕНИЮ КОНЦОВ ХРОМОСОМЫ. Данный феномен носит название концевой недорепликации и является одним из важнейших факторов биологического старения. Так, у новорожденного длина теломер варьирует около 15 тысяч пн при хронических заболеваниях снижается до 5 т.н.п. Ученые из университета Кардиффа (Cardiff University) установили, что критическая длина человеческой теломеры, при которой хромосомы начинают соединяться друг с другом, составляет 12-13 теломерных повторов .
При таком критическом укорочении теломер нарушается структура хромосом, могут повреждаться прилегающие гены и начинают формироваться хромосомные аберрации, которые часто приводят к малигнизации. Чтобы этого не произошло, специальные молекулярные механизмы блокируют клеточное деление, и клетка переходит в состояние покоя - необратимой остановки клеточного цикла. В результате клетка может умереть или перестать делиться. Это происходит в большинстве нормальных соматических клеток, которые имеют ограниченную способность к размножению. В состояние такого покоя клетку могут привести многие стимулы -- дисфункция теломер, повреждения ДНК, причиной которых могут быть мутагенные воздействия окружающей среды, эндогенные процессы, сильные митогенные сигналы (сверхэкспрессия онкогенов Ras, Raf, Mek, Mos, E2F-1 и др.), нарушения хроматина, стрессы и др.
Однако в зародышевых, половых и стволовых клетках имеется специальный фермент - теломераза, способный восстанавливать теломерные последовательности, которые укорачиваются при каждом акте репликации.
Защитные механизмы концевой недорепликации.
Существует специальный фермент -- теломераза (РНК+белок), который при помощи собственной РНК-матрицы достраивает теломерные повторы и удлиняет теломеры. В большинстве дифференцированных клеток теломераза заблокирована, однако активна в стволовых и половых клетках.
Считается, что реактивация теломеразы -- важный этап злокачественных процессов, поскольку это позволяет раковым клеткам «не обращать внимания» на лимит пролиферации. Дисфункция теломер способствует хромосомным слияниям и аберрациям, что чаще всего приводит к злокачественным новообразованиям. Активные теломеразы обнаруживают в 90% раковых опухолей, что обеспечивает неудержимое размножение раковых клеток. Поэтому в настоящее время среди препаратов, которые используют для лечения рака, есть и ингибитор теломеразы.
За открытие защитных механизмов хромосом от концевой недорепликации с помощью теломер и теломеразы в 2009 году присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине австралийке, работающей в США, Элизабет Блекберн (Elizabeth Blackburn), американке Кэрол Грейдер (Carol Greider) и её соотечественнику Джеку Шостаку (Jack Szostack).
Кроме того, в последние годы теломерная ДНК стала предметом пристального изучения из за того, что была обнаружена связь между укорочением теломер и старением.
Другие классы тандемных повторов являются генами для РНК, например, рибосомальной. Эти гены локализованы в ЯОР 5 пар акроцентрических хромосом.
Другая группа повторов - диспергированные повторяющиеся последовательности, которые разбросаны по всему геному по отдельности, а не тандемно. Они являются подвижными (мобильными) генетическими элементами - ретротранспозонами. 15% генома занимают длинные диспергированные элементы - LINE, 12% - короткие SINE. Эти последовательности производят ферменты - эндонуклеазы, способные делать надрезы в ДНК и встраивать туда свои последовательности. Встраивание МГЭ в ДНК способно нарушить функцию гена. У человека известно около 30 ретротранспозиций, вызывающих болезни. Почему же геном не избавляется от таких опасных участков? Повторяющиеся последовательности и МГЭ являются важным источником ремоделирования генома.
Систематизация этих последовательностей, понимание механизмов работы, а также вопросы взаимной регуляции группы генов группой соответствующих ферментов на текущий момент находятся только на начальной стадии изучения. Взаимная регуляция групп генов описывается с помощью сетей регуляции генов. Изучение этих вопросов находится на стыке нескольких дисциплин: прикладной математики, высокопроизводительных вычислений и молекулярной биологии. Знания появляются из сравнений геномов различных организмов и благодаря достижениям в области организации искусственной транскрипции гена в лабораторных условиях.
Все гены по функциям подразделяются на структурные и функциональные.
Структурные гены несут информацию о строении белков и РНК.
Среди функциональных генов выделяют:
гены-модуляторы, усиливающие или ослабляющие работу структурных генов (супрессоры (ингибиторы), активаторы, модификаторы);
гены, регулирующие работу структурных генов (регуляторы и операторы).
геном недорепликация белок
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Генетическая терминология, организация генома вирусов, понятие о лизогенном и литическом цикле. Особенности генома и жизненного цикла ретровирусов, геном бактерий. Современные представления о геноме человека: теоретические и практические аспекты.
презентация , добавлен 04.04.2011
Определение нуклеотидной последовательности генома человека. Идентификация генов на основе физического, хромосомного и функционалного картирования, клонирования и секвенирования. Новая отрасль биологии - протеомика. Изучение структуры и функции белков.
лекция , добавлен 21.07.2009
Организация генома и кодируемые белки вируса иммунодефицита человека. Транскрипция провирусной дезоксирибонуклеиновой кислоты и синтез вирусных веществ. Анализ получения сыворотки и плазмы крови. Характеристика референсных сиквенсов и электрофореграмм.
дипломная работа , добавлен 04.06.2017
Классификация и свойства генов, особенности структурных и регуляторных генов. Структурные единицы наследственности организмов. Особенности генома человека. Наследственный материал, заключенный в клетке человека. Уровни структурной организации хромосом.
презентация , добавлен 28.10.2014
Амплификация как важный механизм увеличения объема генома. Роль горизонтального переноса генетического материала в эволюции генома. Значение сохранения дозового баланса генов в генотипе для формирования фенотипа. Взаимодействия между генами в генотипе.
реферат , добавлен 24.02.2010
Определение возможности развития заболеваний с наследственной предрасположенностью. Создание международной программы "Геном человека". Электромагнитная среда обитания человека. Оценка риска, связанного с использованием ГМО в продуктах питания человека.
реферат , добавлен 01.03.2012
Аминокислотный состав белков в организмах, роль генетического кода. Комбинации из 20 стандартных аминокислот. Выделение белков в отдельный класс биологических молекул. Гидрофильные и гидрофобные белки. Принцип построения белков, уровень их организации.
творческая работа , добавлен 08.11.2009
Общие черты методов изучения наследственности человека, наследственные заболевания и их профилактика. Природа материальных носителей наследственности, механизмы их проявления и изменения. Генеалогический, близнецовый и цитогенический методы исследования.
курсовая работа , добавлен 06.10.2010
Строение молекулы ДНК. Ферменты генетической инженерии. Характеристика основных методов конструирования гибридных молекул ДНК. Введение молекул ДНК в клетку. Методы отбора гибридных клонов. Расшифровка нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.
реферат , добавлен 07.09.2015
Кодирование информации в анализаторах. Слуховой анализатор: информация звукового стимула в виде нейронного возбуждения. Обезболивающая (антиноцицептивная) система. Роль генома в пластических изменениях нервной ткани. Физиологическое значение эмоций.